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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1889/4100

Title: Attività antimicrobica di peptidi anticorpali nei confronti di ceppi fungini e batterici resistenti ai farmaci convenzionali
Other Titles: Antimicrobial activity of antibody-derived peptides against fungal and bacterial strains resistant to conventional drugs
Authors: Cirrone, Erica
Issue Date: Mar-2020
Publisher: Università degli studi di Parma. Dipartimento di Medicina e chirurgia
Document type: Doctoral thesis
Abstract: Il progetto del dottorato di ricerca è stato focalizzato sullo studio dell’attività antimicrobica di peptidi di derivazione anticorpale nei confronti di patogeni fungini e batterici. Diversi peptidi, sintetizzati da sequenze di regioni variabili e costanti di anticorpi, sono stati ampiamente studiati. In particolare, il più conosciuto e studiato peptide con dimostrata attività antimicrobica è un peptide killer chiamato KP, un decapeptide sintetizzato dalla regione variabile di un anticorpo antiidiotipico ricombinante a singolo filamento che rappresenta l’immagine interna funzionale di una tossina killer di lievito. Grazie alla possibilità di manipolare la sequenza amminoacidica di KP per migliorarne le caratteristiche fisico-chimiche, sostituzioni di uno o più amminoacidi nella catena hanno permesso l’ottenimento di altri peptidi caratterizzati da attività antimicrobica potenzialmente più efficace e selettiva. Per lo studio, KP è stato saggiato nei confronti di isolati clinici di Candida spp. resistenti agli azoli, mentre sia KP che alcuni suoi derivati, nello specifico i peptidi K10S, K10T-TT, K10S-SS e A10K-FF, sono stati saggiati nei confronti di ceppi batterici appartenenti alla specie Escherichia coli produttori di β-lattamasi e resistenti ai farmaci β-lattamici, isolati da campioni alimentari di suino. L’importanza clinica dei ceppi batterici e di lievito oggetto di questo studio è data anche dalla loro comune capacità di formare biofilm, motivo per cui i peptidi sono stati saggiati sia nei confronti delle cellule in sospensione che delle cellule che costituiscono il biofilm. KP ha dimostrato una significativa attività antifungina sia nei confronti delle cellule planctoniche che del biofilm dei ceppi appartenenti al genere Candida, anche se nei confronti di quest’ultimo l’attività era leggermente inferiore, per la maggior resistenza del biofilm agli agenti antimicrobici rispetto alle cellule planctoniche. Studi di microscopia confocale hanno dimostrato un accumulo di KP sulla parete della cellula fungina durante le prime ore di trattamento. Inoltre, KP è stato osservato essere anche in grado di indurre la morte cellulare per apoptosi e la produzione intracellulare di specie reattive dell’ossigeno nelle cellule fungine trattate, indistintamente tra ceppi sensibili e resistenti agli azoli, dimostrando un differente meccanismo d’azione tra i due. KP si è dimostrato attivo anche nei confronti delle cellule planctoniche di E. coli a concentrazioni micromolari, ma non nei confronti del biofilm batterico, contro cui non sono state trovate delle significative concentrazioni inibenti la formazione del biofilm. I peptidi K10S, K10T-TT, K10S-SS e A10K-FF derivati da KP sono stati saggiati nei confronti delle cellule planctoniche e del biofilm di E. co,li produttori di ESβL. Anche il peptide K10S, ottenuto da una singola sostituzione amminoacidica nella sequenza di KP, si è dimostrato attivo nei confronti delle cellule in sospensione dei ceppi batterici ma non nei confronti del biofilm, a differenza degli altri peptidi derivati da un maggior numero di sostituzioni amminoacidiche. Tra questi, il peptide K10T-TT si è dimostrato particolarmente attivo sia nei confronti delle cellule in sospensione che del biofilm batterico. Mediante l’impiego della microscopia confocale è stata valutata la vitalità del biofilm batterico dopo trattamento con K10T-TT ed è stata osservata una riduzione generale del numero di cellule vive che costituivano il biofilm, confermando una effettiva riduzione della vitalità dopo trattamento con il peptide.
The PhD research project was focused on the study of the antimicrobial activity of antibody-derived peptides against a large spectrum of pathogens. Several peptides, synthesized from the sequence of variable and constant regions of antibodies, were largely studied. In particular, a killer peptide called KP, a decapeptide synthesized from the variable region of a single-chain recombinant anti-idiotypic antibody representing the internal functional image of a yeast killer toxin, is the most known and studied antibody-derived peptide with demonstrated antimicrobial activity. Due to the possibility to work with the aminoacidic KP sequence to improve its physico-chemical characteristics, with one or more amino acid substitutions in the chain were obtained peptides characterized by more potential efficient and selective antimicrobial activity. For the study, KP was tested against selected clinical isolates of Candida spp., resistant to azoles, while both KP and some KP-derived, specifically K10S, K10T-TT, K10S-SS and A10K-FF peptides, were tested against bacterial strains of Escherichia coli, β-lactamase producers and resistant to β-lactam drugs, isolated from swine meat. Clinical importance of the yeast and bacterial strains studied in this project is further due to their common ability to form biofilm, so the peptides were tested both against planktonic and biofilm-forming cells. KP showed significant antifungal activity against the planktonic cells and the biofilm of Candida strains, though against the latter the activity was slightly lower, due to the higher biofilm-resistance to the antimicrobial agents than the planktonic cells. Confocal microscopy studies showed an accumulation of KP on the fungal cell wall during the first hours of treatment. Instead, KP was observed to induce apoptotic cell death and reactive oxygen species production in the treated-fungal cells, resistant or not to the azoles, proving a different mechanism of action between the two. KP showed antimicrobial activity also against planktonic E. coli cells, at micromolar concentrations, but not against the bacterial biofilm, for which significant biofilm-inhibiting concentrations were not found. KP-derived peptides K10S, K10T-TT, K10S-SS and A10K-FF were also tested against planktonic and biofilm-forming cells of ESBL-producers E. coli. K10S, a peptide with a single amino acid substitution in the KP sequence, showed antimicrobial activity against planktonic cells but not against the biofilm, unlike the other peptides, with more amino acid substitutions. Among these, K10T-TT showed to be active both against planktonic cells that bacterial biofilm. Using confocal microscopy the bacterial biofilm vitality was evaluated after treatment with K10T-TT and a general reduction of the number of vital biofilm-forming cells was observed, confirming an effective vitality reduction after treatment with the peptide.
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