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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1889/4023

Title: Chaperoni molecolari e Malattia di Parkinson: Ruolo di Clusterina nel processo di aggregazione di alfa-Sinucleina
Other Titles: Molecular chaperones and Parkinson’s Disease: Role of Clusterin in the aggregation process of alpha-Synuclein
Authors: Lenzi, Chiara
Issue Date: Mar-2020
Publisher: Università degli studi di Parma. Dipartimento di Medicina e chirurgia
Document type: Doctoral thesis
Abstract: Un comune aspetto a molte malattie neurodegenerative è la presenza di inclusioni proteiche, costituite prevalentemente da proteine endogene mal ripiegate. Nella malattia di Parkinson (MP) e nelle altre malattie, note come malattie dei corpi di Lewy (LBD), α-Sinucleina (αSyn) costituisce la principale componente proteica delle inclusioni citoplasmatiche, definite Lewy Body (LB), che caratterizzano queste patologie. αSyn normalmente non presenta una struttura secondaria definita, mentre in condizioni patologiche adotta una conformazione a foglietto-β che si ritiene essere coinvolta o innescare eventi di aggregazione. Numerosi studi sperimentali evidenziano che il processo di aggregazione di αSyn sia un punto chiave nella patogenesi delle LBD e questo sottolinea come il mantenimento dell’omeostasi proteica sia di fondamentale importanza per garantire la corretta funzionalità cellulare. Le cellule presentano diversi sistemi di controllo qualità delle proteine e le Heat Shock Proteins (HSP) ne identificano una delle componenti principali, in quanto stabilizzano parzialmente le proteine unfolded, dissociano gli aggregati proteici o dirigono le proteine misfolded verso i sistemi di degradazione cellulare. Diverse HSP sono state ritrovate nei LB, come anche Clusterina (CLU), una glicoproteina ubiquitaria secreta che evidenzia un’attività simile a quella delle HSP. CLU è identificata come uno chaperone ATP-indipendente extra-cellulare, ma sebbene sia destinata alla secrezione, è stato dimostrato che in condizioni di elevato stress viene favorita la sua ritenzione intracellulare con localizzazione nel citosol ed in altri sub-compartimenti cellulari. È stato, dimostrato che CLU lega alcune proteine misfolded sia nello spazio extracellulare, sia all’interno delle cellule, e le scorta verso altri chaperoni o verso i sistemi proteolitici. Nonostante differenti studi attribuiscano a CLU un ruolo importante nel sistema di controllo della proteostasi cellulare nella malattia di Alzheimer (MA), il ruolo che svolge nella patogenesi della MP, non è ancora stato indagato, sebbene diverse evidenze sperimentali suggeriscano un suo possibile coinvolgimento anche in questa patologia. A tal proposito, lo scopo del progetto è indagare se CLU esercita un ruolo nei meccanismi di difesa cellulare attivati per contrastare gli effetti della sovrespressione di αSyn e la formazione e/o clearance degli aggregati di questa proteina. Lo studio è stato effettuato articolando l’attività sperimentale in modelli di complessità crescente, impiegando colture cellulari per la sperimentazione in vitro, modelli animali per la sperimentazione in vivo (in collaborazione con l’Università di Modena e Reggio Emilia) e includendo anche valutazioni retrospettive molecolari, eseguite presso l’Università di Oxford, su campioni di tessuto cerebrale umano appartenenti a soggetti affetti da LBD. I dati ottenuti con questo lavoro hanno per la prima volta messo in luce un coinvolgimento di CLU nel processo di aggregazione di αSyn. Abbiamo constatato che i livelli di questo chaperone sono up-regolati già in una fase precoce e spesso asintomatica della malattia, come mostrato dalle analisi ex vivo e in modelli cellulari di sovrespressione di αSyn (analisi in vitro). Dalle analisi è emerso, inoltre, che in cellule sovraesprimenti αSyn, prima della formazione di oligomeri ed aggregati insolubili, quando l’attivazione dell’UPR è ancora irrilevante, CLU è l’unico chaperone, tra quelli analizzati (Hsp27, Hsp70 e Hsp90), ad aumentare significativamente la propria espressione, suggerendo un ruolo specifico nel controllo del folding di αSyn. Al fine di verificare il suo ruolo in questo contesto, gli esperimenti di loss-of-function hanno mostrato come il silenziamento di CLU favorisca la formazione di aggregati insolubili di αSyn, anche in assenza di trattamento con MG132, un farmaco utilizzato per bloccare il proteasoma e aggravare lo stress proteotossico, senza modificare significativamente l’UPR, la sopravvivenza cellulare, l’attivazione delle caspasi o determinare un aumento compensativo del livello di espressione di nessuno degli altri chaperoni analizzati. Le prove di co-immunoprecipitazione suggeriscono, inoltre, che CLU interferisca con il processo di aggregazione di αSyn attraverso un’interazione diretta fra le due proteine. Nell’ultima parte di questo lavoro sono stati studiati gli effetti della delezione genica di CLU in un modello murino di MP indotto da neurotossine. I risultati evidenziano che gli animali C57Bl/6CLU-/- (CLU-KO) hanno comportamento locomotorio, attitudine esplorativa e forza muscolare paragonabile rispetto ai fratelli di lettiera che esprimono normali livelli di proteina C57Bl/6CLU+/+ (WT). L’estensione della neurodegenerazione indotta da iniezione unilaterale stereotassica intracranica di rotenone è stata inferiore al 50%, sia in animali WT e CLU-KO, con livelli individuali estremamente variabili, probabilmente correlabili alla scarsa riproducibilità della procedura di iniezione streotassica. Inoltre, la sola iniezione di veicolo ha indotto livelli di neurodegenarazione paragonabili al farmaco negli animali CLU-KO ma non nei WT. Tutto questo ha reso impossibile misurare differenze statisticamente significative negli effetti causati dal trattamento e dal genotipo sulla neurodegenarazione. Non di meno, il fatto che il solo veicolo abbia determinato neurodegenarazione negli animali CLU-KO, unitamente al risultato del test di lateralizzazione, suggerisce un possibile ruolo neuroprotettivo per CLU. Il coinvolgimento di CLU nel processo di aggregazione di αSyn dimostrato in questo lavoro di tesi, rappresenta un punto di partenza per il consolidamento di nuove conoscenze potenzialmente utili allo sviluppo di strategie farmacologiche mirate a contrastare l’alterazione dell’equilibrio della proteostasi, evento precoce e comune delle malattie da misfolding.
A common aspect to many neurodegenerative diseases is the presence of protein inclusions, consisting mainly of endogenous misfolded proteins. In Parkinson's Disease (PD) and other diseases known as Lewy body diseases (LBD), α-synuclein (αSyn) is the main protein component of cytoplasmic inclusions called Lewy Body (LB). Normally, αSyn does not have a defined secondary structure but in pathological conditions it adopts a β–sheet conformation that is believed to trigger or to be involved in the aggregation events. Numerous studies show that the αSyn aggregation process is a key event in the pathogenesis of LBD, pointing out how the protein homeostasis is important to guarantee the correct cellular functionality. Cells have different protein quality control systems, among which the Heat Shock Proteins (HSP) identifies one of the main components, as they partially stabilize the unfolded proteins, dissociate the protein aggregates or direct the misfolded proteins towards cell degradation systems. Several HSP have been found in LB, as well as Clusterina (CLU), a secreted ubiquitous glycoprotein that shows an activity similar to that of HSP. CLU is identified as an extra-cellular ATP-independent chaperone, but although it is destined to secretion, it has been shown that under high stress conditions its intracellular retention and localization in the cytosol and in other cellular sub-compartments is favoured. It has been shown that CLU binds misfolded proteins, both in the extracellular space and within cells, and directs them to other chaperones or degradative systems. Although different studies shed light the CLU role in Alzheimer's Disease (AD), its role in the pathogenesis of PD has not yet been investigated, although some studies suggest its possible involvement also in this pathology. In this regard, the aim of the project is to investigate the role of CLU in the cellular mechanisms activated to counteract the burden of αSyn overexpression and the formation and/or clearance of its aggregates. The study was carried out in experimental models of increasing complexity, using cell cultures for in vitro study, animal models for in vivo study (in collaboration with the University of Modena and Reggio Emilia) and also including molecular retrospective evaluations performed at the University of Oxford, on human brain tissue samples of patients with LBD. The obtained results highlighted for the first time the involvement of CLU in the αSyn aggregation process. In particular, we demonstrate that the CLU levels is up-regulated already at an early stage of the disease, as shown by the ex vivo analyses and in cellular models of αSyn overexpression (in vitro analysis). The analyses also showed that in αSyn overexpressing cells, before the formation of oligomers and insoluble aggregates, when the activation of the UPR is still irrelevant, CLU is the only chaperone among those analysed (Hsp27, Hsp70 and Hsp90), whose expression is increased, suggesting an its specific role in the folding and/or clearance of αSyn aggregates. In this regards, loss-of-function experiments showed that CLU downregulation favours the formation of αSyn insoluble aggregates, even in the absence of MG132 treatment (a drug used to block the proteasome triggering an proteotoxic stress), without significantly modifying the UPR pathway, cell survival, caspase activation or determining a compensatory increase expression of the other HSP analysed. Co-immunoprecipitation experiments also suggest that CLU interferes with the αSyn aggregation process through a direct interaction between the two proteins. The effects of the CLU gene deletion were also studied in a murine model of PD. The results show that the animals C57Bl/6CLU-/- (CLU-KO) have locomotor behaviors, exploratory aptitude and muscle strength comparable to that of C57Bl /6CLU+/+ (WT) animals, expressing normal levels of CLU. The extent of neurodegeneration induced by unilateral intracranial stereotactic injection of rotenone was less than 50%, both in WT and CLU-KO animals, with extremely variable individual levels, probably correlated to the low reproducibility of the streotaxic injection procedure. Furthermore, the vehicle injection alone induced a level of neurodegeneration comparable to that of rotenone in CLU-KO animals but not in WT. Because of these experimental troubles we are not able to define the effect exerted by treatment and animal’s genotype on the neurodegeneration process. Nevertheless, taken together that the vehicle alone triggered the neurodegeneration process in CLU-KO animals and the results of the lateralization test, it is possible to suggest a neuroprotective role for CLU. The CLU involvement in the αSyn aggregation process demonstrated in this thesis, represents a starting point to develop new pharmacological strategies aimed at counteracting the proteostasis impairment, the early and common event in misfolding disease.
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