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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: http://hdl.handle.net/1889/3552

Titolo: Female infertility: in vitro maturation of antral oocytes upon a feeder layer of selected cumulus cells improves developmental competence
Titolo alternativo: Female infertility: in vitro maturation of antral oocytes upon a feeder layer of selected cumulus cells improves developmental competence
Autori: Cavalera, Federica
Data: 15-mar-2018
Editore: Università di Parma. Dipartimento di Medicina e Chirurgia
Tipo di documento: Doctoral thesis
Abstract: Secondo l’organizzazione mondiale della sanità (WHO) l’infertilità colpisce circa il 20% delle coppie nei paesi occidentali. A questo dato si aggiunge un numero sempre più crescente di donne (280.000/anno, Stati Uniti e 58.000/anno, Italia) che, sottoponendosi a trattamenti chemio/radio terapici, sviluppa sindrome da prematuro decadimento ovarico. L’isolamento e la crioconservazione di oociti immaturi denudati (DOs) è una possibile strategia impiegata per preservare la fertilità di queste pazienti, in particolare quando i DOs sono coltivati fino a metafase II in presenza di un feeder layer di cellule del cumulo (FL-CCs). Durante il mio dottorato, ho messo a punto un nuovo sistema miniaturizzato di coltura in vitro di DOs su un FL di CCs selezionate in base alla loro appartenenza a oociti competenti o incompetenti allo sviluppo. Due sono stati i principali obiettivi della mia ricerca: 1. Testare l’ipotesi che la selezione delle CCs possa avere un effetto migliorativo sulle rese di sviluppo. Classificando CCs in base alla loro associazione con oociti antrali competenti (SN) o incompetenti (NSN) allo sviluppo, abbiamo preparato, in delle micro-Insert 4 well plates, un FL di SN-CCs o NSN-CCs. Abbiamo dimostrato, così, che la maturazione di DOs su FL-SN-CCs contribuisce significativamente all’acquisizione della competenza meiotica e di sviluppo, con una percentuale di blastocisti (26.9%) simile a quella ottenuta dalla maturazione di follicoli integri (28%). Al contrario, quando i DOs sono maturati in assenza di CCs (NO-FL) o su FL-NSN-CCs vanno incontro ad un blocco della ripresa meiotica e dello sviluppo, con arresto degli embrioni agli stadi di 4 cellule o morula. 2. Identificazione dell’intervallo di tempo, durante la fase maturativa, in cui il feeder layer SN-FL-CCs influenza maggiormente l’acquisizione della competenza allo sviluppo dell’oocita. A tal fine, ho coltivato DOs secondo tre diverse condizioni sperimentali: 1. in assenza di FL-SN-CCs per 3 hr e su FL-SN-CCs per le successive 12 hr; 2. in assenza di FL-SN-CCs per 6 hr e su FL-SN-CCs per le successive 9 hr; 3. su SN-FL-CCs per 6 hr ed in assenza di FL-SN-CCs per le successive 9 hr. Quando i DOs sono stati coltivati seguendo il protocollo 1, lo sviluppo da 2 a 4 cellule è rimasto simile a quello ottenuto quando i DOs sono stati coltivati su FL-SN-CCs per tutte le 15 hr di coltura, suggerendo una corretta transizione oocita-embrione. Al contrario, le rese di blastocisti sono diminuite significativamente, indicando un’alterazione di processi chiave dello sviluppo pre-impianto. Inoltre, se l’ assenza di CCs veniva prolungata per 6 hr, nessun embrione raggiungeva lo stadio di blastocisti. Ancor più dannosa è stata l’assenza del FL-SN-CCs nelle ultime 9 hr di coltura, portando ad un completo arresto dello sviluppo a 2 cellule. I risultati di questi tre set di esperimenti suggeriscono la presenza di un importante fattore/i paracrino/i rilasciato da FL-SN-CCs, presumibilmente nel terreno di coltura, la cui assenza risulta esser dannosa per l’acquisizione della competenza allo sviluppo dell’oocita. In conclusione, mentre le cellule SN contribuiscono positivamente nel determinare l’acquisizione della competenza meiotica e di sviluppo embrionale, la mancanza di questo supporto, riscontrabile sia in presenza di un FL di cellule NSN sia in assenza di FL, porta al fallimento della capacità meiotica e di sviluppo dell’oocita. Inoltre, i nostri risultati hanno posto le basi per meglio comprendere quali siano le molecole coinvolte nella comunicazione bidirezionale tra le cellule del cumulo ooforo ed il gamete durante il passaggio dallo stadio di vescicola germinale a quello di metafase II.
The World Health Organization (WHO) estimates that infertility affects about 20% of couples in western countries. In addition, one third of women undergoing oncological treatments develops premature ovarian failure as a consequence of aggressive chemo- or radio- therapies. In numbers, 280.000/year in USA (American Cancer Society; cancer.org) and 58.000/year in Italy (Associazione Italiana di Oncologia Medica; registri-tumori.it). The isolation and cryopreservation of denuded antral germinal vesicle oocytes (DOs) has been seen, in recent years, as a strategy for preserving fertility of these patients, particularly when DOs are in vitro matured to metaphase II (MII) in the presence of a feeder layer of cumulus cells (FL-CCs). To this regard, the work I carried out during my PhD was focused on the development of a new miniaturized culture system based on DOs maturation upon a FL of selected CCs. In the pursuit of this goal, two were the main specific aims of my research: 1. To test the hypothesis that improvements could be introduced by a selection of CCs prior to the preparation of the FL. In this study we classified CCs based on their association with developmentally competent (SN) or incompetent (NSN) mouse fully-grown antral oocytes and then, developed a miniaturized system, a micro-Insert 4 well plate, to obtain a FL of SN-CCs or NSN-CCs. We show, for the first time, that maturation of DOs upon FL-SN-CCs significantly better contributes to the acquisition of oocytes meiotic and developmental competence, with a developmental rate to blastocyst (26.9%) equal to that obtained after the maturation of intact cumulus oocyte complexes (28%). Instead, DOs matured in the absence of CCs (NO-FL) or upon FL-NSN-CCs undergo meiotic and developmental failure, with embryos arresting either at the 4-cell or morula stage. 2. The identification of the time-lapse interval, during the germinal vesicle-to-metaphase II transition, in which the SN-FL-CCs mainly influences the acquisition of oocyte developmental competence. To this end, I cultured DOs under three different experimental conditions: V 1. without FL-SN-CCs for 3 hr and upon FL-SN-CCs for further 12 hr; 2. without FL-SN-CCs for 6 hr and upon FL-SN-CCs for further 9 hr; 3. upon an SN-FL-CCs for 6 hours and then without FL-SN-CCs for further 9 hr. When DOs were cultured following protocol 1, the progression to the 2- and 4-cell stages remained similar to that obtained when DOs were cultured upon FL-SN-CCs for the whole 15 hr, suggesting a correct oocyte-to-embryo transition. Instead, the frequency of development to blastocyst decreased significantly, indicating an alteration to key developmental processes. Furthermore, when the initial culture in the absence of CCs was prolonged to 6 hr, none of the embryos reached the blastocyst. Even more detrimental was the absence of FL-SN-CCs during the latest 9 hr culture, with a complete developmental arrest at the 2-cell stage. Overall, the results of these three sets of experiments suggest the presence of an essential paracrine factor/s released from FL-SN-CCs, likely into the culture medium, whose lack is detrimental to the acquisition of a proper developmental competence. In conclusion, the main finding of my study is the demonstration of a positive contribution to the acquisition of the oocyte meiotic and developmental competence of SN-CCs. Lack of this support, either in the absence of CCs (NO-FL) or in the presence of NSN-CCs, results in meiotic and developmental failure. Furthermore, our results set the bases to further improve the protocols of antral oocytes maturation upon a feeder layer of CCs and to unravel the molecules involved in the cross-talk between the gamete and its companion cumulus cells during the germinal vesicle (GV)-to-MII transition.
InMedicina molecolare, tesi di dottorato

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Federica Cavalera tesi di dottorato Medicina Molecolare XXX ciclo.pdfTesi di dottorato in Medicina Molecolare XXX ciclo1,73 MBAdobe PDFconsultabile a partire dal: 1/4/2019
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